在現(xiàn)代生物技術(shù)中，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA) 被廣泛用于確定生物樣品中抗原、抗體、肽、蛋白質(zhì)、激素或其他生物分子的存在和數(shù)量。由于其靈敏度高，它可以識(shí)別出甚至最小的抗原濃度。

  

  ELISA 的敏感性歸因于其識(shí)別單個(gè)抗原抗體復(fù)合物之間相互作用的能力。

  

  Elisa 試劑盒在不斷變化的醫(yī)學(xué)研究和診斷領(lǐng)域 中至關(guān)重要。由于其卓越的準(zhǔn)確性和適應(yīng)性，這些試劑盒對(duì)于解決醫(yī)學(xué)難題和研究新療法至關(guān)重要。隨著科學(xué)好奇心和技術(shù)進(jìn)步，它們的用途已擴(kuò)展到從傳染病到癌癥生物標(biāo)志物識(shí)別等各個(gè)領(lǐng)域。它們每天都在開辟新天地，幫助改善患者護(hù)理并實(shí)現(xiàn)革命性的醫(yī)學(xué)進(jìn)步。

  

  認(rèn)識(shí)ELISA

  

  “酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法”或簡(jiǎn)稱“ELISA”于 1971 年首次使用，指用于測(cè)量抗原濃度的酶基免疫測(cè)定技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA) 試劑盒用于研究檢測(cè)和量化樣本內(nèi)的特定蛋白質(zhì)序列和其他靶標(biāo)。使用正確的ELISA 試劑盒 可提供精確、可量化的數(shù)據(jù)，以確認(rèn)和支持您的研究。在科研實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目選擇適當(dāng)?shù)脑噭┖蓄愋停ㄖ苯?、間接、夾心或競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA）。高質(zhì)量的ELISA試劑盒經(jīng)過精心設(shè)計(jì)，能夠容忍一定的技術(shù)差異，并幫助您獲得更準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

  

  ELISA 試劑盒在細(xì)胞因子檢測(cè)中的應(yīng)用

  

  ELISA 技術(shù)包括多種免疫測(cè)定方法，不同的方法在具體步驟和應(yīng)用場(chǎng)景上有所差異。幾種關(guān)鍵參數(shù)，例如要檢測(cè)的抗原類型、針對(duì)特定抗原的單克隆抗體以及必要的測(cè)試靈敏度，決定了應(yīng)采用哪種類型的 ELISA。夾心 ELISA 由于具有高靈敏度和特異性，在細(xì)胞因子檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。間接ELISA 也是常用的方法之一。

  

  1. 夾心 ELISA

  

  細(xì)胞因子夾心 ELISA 是一種靈敏的酶聯(lián)免疫測(cè)定法，可以精確識(shí)別和測(cè)量可溶性趨化因子和細(xì)胞因子蛋白的量?；炯?xì)胞因子夾心 ELISA 方法使用高純度的抗細(xì)胞因子抗體（捕獲抗體）。這些抗體非共價(jià)吸附在塑料微孔板上。固定化抗體可選擇性地結(jié)合洗板后加入板中的樣品中的可溶性細(xì)胞因子蛋白。

  

  去除未結(jié)合的物質(zhì)后，使用生物素偶聯(lián)的抗細(xì)胞因子抗體（檢測(cè)抗體）來識(shí)別已收集的細(xì)胞因子蛋白。隨后是酶標(biāo)記的親和素或鏈霉親和素步驟。

  

  ELISA 讀數(shù)儀 可 用于在添加顯色底物后，以可接受的光密度 (OD) 分光光度法簡(jiǎn)單地量化結(jié)合的酶聯(lián)檢測(cè)試劑產(chǎn)生的有色產(chǎn)物的量。當(dāng)板讀數(shù)儀與計(jì)算機(jī)連接時(shí)，數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和重新分析變得更加容易。

  

  ELISA 夾心法 是測(cè)量分析物時(shí)獲得高精度的首選方法。這種方法可以揭示分析物的特異性和靈敏度，首先使用捕獲抗體固定分析物。當(dāng)添加帶有酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體時(shí)，夾心結(jié)構(gòu)就像積木一樣組裝起來。它通過識(shí)別分析物上的另一個(gè)表位來完成復(fù)雜的夾心結(jié)構(gòu)。

  

  2. 間接 ELISA

  

  間接 ELISA 是一種利用二抗識(shí)別一抗抗原特異性抗體的方法。間接ELISA中，二抗的標(biāo)記酶和二抗的親和力可以影響靈敏度和信號(hào)放大。兩種抗體在這種配置下共同作用，增強(qiáng)信號(hào)并提高靈敏度，使分析物更容易被檢測(cè)到。

  

  一抗具有高特異性，可以特異性識(shí)別分析物，并與之形成牢固的結(jié)合。然后，二抗通過其與一抗的結(jié)合位點(diǎn)特異性識(shí)別并結(jié)合到一抗上。二抗通常被標(biāo)記上酶，例如辣根過氧化物酶（HRP），當(dāng)加入底物時(shí)，酶會(huì)催化底物反應(yīng)，產(chǎn)生顏色變化或化學(xué)發(fā)光信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)分析物的檢測(cè)。

  

  間接ELISA在檢測(cè)細(xì)胞因子時(shí)靈敏度通常較高，這主要是因?yàn)槎沟臉?biāo)記酶可以放大信號(hào)，從而提高檢測(cè)靈敏度。間接ELISA的靈敏度取決于多種因素，包括一抗的親和力和特異性、二抗的親和力和標(biāo)記酶的活性、底物的敏感性和穩(wěn)定性以及實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范性。

  

  此外，一種酶偶聯(lián)的二抗可以識(shí)別來自同一物種的多種一抗。這為用戶提供了根據(jù)需要在檢測(cè)不同抗原的幾種ELISA中使用相同的酶偶聯(lián)二抗的選擇，但前提是這些抗原來自同一物種，并且二抗能夠識(shí)別這些抗原。相關(guān)閱讀：《elisa試劑盒有哪幾種類型？elisa四類型圖解》

  

  選擇合適的 ELISA 試劑盒

  

  考慮以下幾點(diǎn)將有助于您的 ELISA 試劑盒發(fā)揮最佳作用：

  

  1.抗體的特異性

  

  ELISA 測(cè)試中抗體的選擇 取決于特異性和親和力標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)定義，單克隆抗體結(jié)合更精確，可降低背景信號(hào)。多克隆抗體和單克隆抗體可以一起使用或單獨(dú)使用。雖然多克隆抗體會(huì)產(chǎn)生更高的信號(hào)，但非特異性結(jié)合也會(huì)更普遍。每次還需要進(jìn)行廣泛的測(cè)試，因?yàn)槎嗫寺】贵w會(huì)表現(xiàn)出更多的批次間差異。

  

  術(shù)語“匹配對(duì)”描述的是您在實(shí)驗(yàn)中用來檢測(cè)單一抗原的單克隆抗體、多克隆抗體或兩種抗體的混合物。這些抗體應(yīng)該已被證明能夠通過結(jié)合多個(gè)表位并作為有效的“捕獲”和“檢測(cè)”對(duì)發(fā)揮良好作用。

  

  2. 靈敏度和檢測(cè)范圍

  

  每種 ELISA 試劑盒都旨在檢測(cè)不同的靶標(biāo)，并具有獨(dú)特的功能；它們并非普遍適用。了解您的 ELISA 試劑盒的靈敏度和特異性，以及每個(gè)步驟的精確增強(qiáng)，將提供準(zhǔn)確可靠的標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示您的靶標(biāo)的測(cè)量值。

  

  每個(gè)包裝中都會(huì)包含針對(duì)每個(gè)目標(biāo)量身定制的試劑和 ELISA 緩沖液。在測(cè)試開始時(shí)，請(qǐng)確保您了解每組參數(shù)，例如抗體類型、孵育時(shí)間、溫度和報(bào)告系統(tǒng)。如果您事先熟悉這些參數(shù)，這將為您節(jié)省大量時(shí)間和煩惱。

  

  3. 樣本兼容性

  

  了解特定 ELISA 試劑盒是否與樣本（基質(zhì)）的組成兼容（或不兼容）。試劑盒的性能通常使用各種基質(zhì)進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果通常顯示在說明書和其他支持材料中。確保您知道 ELISA 試劑盒在樣本（尿液、組織培養(yǎng)、血漿、血清等）基質(zhì)中的描述有多詳盡。雖然這并不一定意味著試劑盒不起作用，但它將有助于了解您是否需要更多的驗(yàn)證試驗(yàn)來確定它在您感興趣的基質(zhì)中的表現(xiàn)如何。

  

  4. 驗(yàn)證和質(zhì)量控制

  

  使用不同稀釋度的對(duì)照樣品進(jìn)行一些測(cè)試以生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，并充分利用您的試劑盒。保存您最好的樣品，等您知道要使用的適當(dāng)稀釋度時(shí)再使用。了解要使用的樣品和稀釋度后，您可以最有效地安排您的板。確保您使用所有孔，并遵守試劑盒的說明。如果根據(jù)給出的信息需要額外的檢測(cè)試劑，請(qǐng)?zhí)砑铀?/span>

  

  實(shí)驗(yàn)方案

  

  生成有價(jià)值且有意義的數(shù)據(jù)時(shí)，應(yīng)力求準(zhǔn)確和可重復(fù)。始終牢記 ELISA 協(xié)議，以確保一致性、最佳性能和精確結(jié)果。以下是需要考慮的實(shí)驗(yàn)協(xié)議：

  

  1.在開始實(shí)驗(yàn)之前，讓試劑盒試劑約 30 分鐘達(dá)到室溫或指定溫度。

  

  2.冷凍樣品必須完全解凍，并且凍融循環(huán)次數(shù)應(yīng)保持最少 - 不超過三次。

  

  3.在實(shí)驗(yàn)期間和實(shí)驗(yàn)之間保持一致的環(huán)境條件，例如溫度和濕度。

  

  4.確保每件設(shè)備（例如讀取器、洗板機(jī)和移液器）都經(jīng)過校準(zhǔn)。

  

  5.使用足量的抗體。

  

  6.使用新鮮配制的底物溶液，而不是在使用前將其儲(chǔ)存數(shù)小時(shí)。

  

  7.在測(cè)試期間，一致地處理樣本并遵守相同的協(xié)議。

  

  8.操作過程中目視檢查吸頭和孔，確保吸液、試劑添加和取出準(zhǔn)確。液位應(yīng)相同。

  

  9.為了保證ELISA檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，請(qǐng)勿混合不同批次或不同品牌的試劑。每個(gè)ELISA試劑盒的組裝方式是使各個(gè)組件作為一個(gè)整體發(fā)揮作用，在檢測(cè)之間進(jìn)行大量混合可能會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響，例如影響反應(yīng)靈敏度、特異性等。

  

  10.試劑使用后絕不可放回瓶中。

  

  11.測(cè)試后，請(qǐng)將托盤關(guān)閉以防止孔變干。

  

  成功檢測(cè)細(xì)胞因子的秘訣

  

  1. 樣品制備

  

  在開始主要實(shí)驗(yàn)之前，請(qǐng)使用少量樣本確定適當(dāng)?shù)南♂尫秶Ｄ臉颖颈仨毰c微量滴定板測(cè)試的格式兼容。所檢查的生物標(biāo)記物的數(shù)量總是會(huì)有所不同。

  

  由于您要尋找符合樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)，因此請(qǐng)使用試劑盒的說明作為指南。請(qǐng)注意，含有膽紅素或其他干擾因素的樣品會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的發(fā)現(xiàn)。以下樣品可與 ELISA 試劑盒一起使用：細(xì)胞裂解物、血清、唾液、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

  

  2. 已知濃度的滴定標(biāo)準(zhǔn)品

  

  已確定濃度的滴定 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于任何 ELISA 都是必不可少的，因?yàn)樗鼈兪褂脩裟軌虼_定測(cè)試樣品中的抗原濃度。為了創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，通常留出一系列孔，并將已知量的純化重組蛋白逐漸添加到孔中。

  

  然后，用戶可以從微孔板讀數(shù)儀中獲取已知蛋白質(zhì)濃度的一組參考吸光度值，以便在這些孔與測(cè)試樣品同時(shí)處理時(shí)與測(cè)試樣品的吸光度值相匹配。

  

  之后，您可以計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此來比較測(cè)試樣本以確定所需蛋白質(zhì)的濃度。用戶稀釋的準(zhǔn)確度也可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來驗(yàn)證。

  

  3. 添加底物

  

  孔中的酶量與ELISA 底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的量直接相關(guān)。最常見的附著在抗體上的酶是堿性磷酸酶 (AP) 和辣根過氧化物酶 (HRP)。可以假設(shè)，針對(duì)每種酶定制的各種底物都可以產(chǎn)生熒光或顯色產(chǎn)物。

  

  此外，底物的敏感性各不相同，這可能會(huì)提高檢測(cè)的總敏感性。在選擇合適的底物和酶聯(lián)抗體時(shí)，還必須考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)讀取 ELISA 板的設(shè)備。

  

  4.檢測(cè)與分析

  

  確定 ELISA 靈敏度的一種傳統(tǒng)方法是選擇產(chǎn)生的信號(hào)至少比平均背景信號(hào)值高出兩個(gè)或三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的最低細(xì)胞因子濃度。

  

  特定細(xì)胞因子和趨化因子蛋白存在于混合細(xì)胞因子環(huán)境中，例如受刺激的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液。因此，夾心 ELISA 可以量化這些蛋白質(zhì)的生理相關(guān)量，這是由于檢測(cè)抗體信號(hào)的酶介導(dǎo)擴(kuò)增。

  

  如何分析 ELISA 數(shù)據(jù)

  

  1. 結(jié)果計(jì)算

  

  在 ELISA 過程中，通過將未知樣本的值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來確定未知樣本的值。在樣本稀釋的情況下，稀釋倍數(shù)需要乘以從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的濃度值。ELISA 樣本應(yīng)始終重復(fù)三次或兩次，以提供具有足夠數(shù)據(jù)的結(jié)果來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)驗(yàn)證。

  

  對(duì)于每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)、對(duì)照和樣品，計(jì)算兩次或三次測(cè)量的平均值，并扣除平均零標(biāo)準(zhǔn)光密度 (OD)。重復(fù)數(shù)據(jù)的變異系數(shù) (CV) 不應(yīng)超過 20%。

  

  2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線

  

  使用計(jì)算機(jī)軟件繪制平均吸光度與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系，以創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。確保遵循ELISA 測(cè)試協(xié)議建議的數(shù)據(jù)縮減技術(shù)。

  

  將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞因子蛋白溶液連續(xù)稀釋，以創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將其添加到夾心 ELISA 測(cè)試中。這些標(biāo)準(zhǔn)曲線也稱為“校準(zhǔn)曲線”。它們通常是通過將標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞因子蛋白濃度（通常以 ng 或 pg 細(xì)胞因子/ml 表示）與相應(yīng)的重復(fù)平均 OD 值作圖來制作的。

  

  可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷出疑似含有細(xì)胞因子的樣本的濃度。ELISA 計(jì)算機(jī)軟件程序可幫助完成此操作。為確保 OD 位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性區(qū)域內(nèi)，請(qǐng)確保對(duì)未知樣本進(jìn)行一系列稀釋。研究人員可以選擇對(duì)其數(shù)據(jù)應(yīng)用各種曲線擬合分析，例如線性對(duì)數(shù)、對(duì)數(shù)對(duì)數(shù)或四參數(shù)轉(zhuǎn)換，具體取決于所用的 ELISA 試劑類型。

  

  如果沒有軟件，可以通過在線性尺度上繪制濃度對(duì)數(shù)與 OD 對(duì)數(shù)的圖來線性化 ELISA 數(shù)據(jù)分析?？梢允褂没貧w分析來找到最佳擬合線。此過程將產(chǎn)生足夠但不太準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)擬合。

  

  3. 計(jì)算變異系數(shù)

  

  變異系數(shù) (CV) 描述的是標(biāo)準(zhǔn)差與平均值的比率，通常以百分比表示。CV 計(jì)算至關(guān)重要，因?yàn)樗赡軙?huì)揭示 ELISA 數(shù)據(jù)中的任何差異或錯(cuò)誤。重復(fù)數(shù)據(jù)的變異系數(shù) (CV) 不應(yīng)超過 20%。較高的 CV 表示不準(zhǔn)確和潛在錯(cuò)誤較多。

  

  ELISA 常見問題的排除

  

  每種 ELISA 都有某些缺點(diǎn)。首先，存在一個(gè)問題，即測(cè)試樣品中存在多少目標(biāo)蛋白質(zhì)。如果數(shù)量過高或過低，微孔板讀數(shù)器產(chǎn)生的吸光度讀數(shù)可能分別超出或低于標(biāo)準(zhǔn)曲線的限值。因此，估計(jì)測(cè)試樣品中蛋白質(zhì)的精確數(shù)量將具有挑戰(zhàn)性。

  

  如果讀數(shù)非常高，在將測(cè)試樣品放入板孔之前先稀釋它。根據(jù)稀釋倍數(shù)，必須修改最終數(shù)字。DIY 試劑盒有時(shí)需要仔細(xì)優(yōu)化抗體濃度以獲得良好的信噪比。

  

  如今 ELISA 技術(shù)已被改進(jìn)以量化不同實(shí)驗(yàn)樣本中的抗原水平。然而，它們背后的基本思想是相同的。在選擇是否采用間接或夾心 ELISA 進(jìn)行細(xì)胞因子檢測(cè)時(shí)，待檢測(cè)樣本的復(fù)雜程度和抗原特異性抗體的可用性是至關(guān)重要的考慮因素。

  

  當(dāng)確定免疫反應(yīng)的結(jié)果（例如確定樣本中抗體的含量）時(shí)，可以使用間接 ELISA。當(dāng)檢查復(fù)雜樣本時(shí)，如果分析物或靶抗原存在于混合樣本中（如組織裂解物或培養(yǎng)上清液），夾心 ELISA 是最合適的方法。