ELISA，一種酶聯(lián)免疫吸附測定法，是一種基于分析板的生化免疫測定法。它廣泛應用于生命科學和生物化學實驗室，用于生物分子的定量，例如蛋白質(zhì)、抗體、肽、糖蛋白和激素。

 

  該技術利用抗原和抗體之間的相互作用來產(chǎn)生可測量的結果?？乖且环N啟動免疫反應的外來蛋白質(zhì)，其中可能包括與抗體復合后的一系列反應?？贵w是生物體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。ELISA測定中涉及的兩種抗體是一抗和二抗。關于抗原和抗體可以參考《免疫學檢測：一抗和二抗簡介》

 

  在該技術中，抗原被固定在ELISA板的表面，然后與酶綴合物抗原特異性抗體一起孵育。這導致抗原-抗體復合物的形成。然后使用特定底物和合適的檢測方法，通過孵育含有抗原-抗體復合物的ELISA板來檢測反應產(chǎn)物。

 

  在實驗室遵循的通用ELISA方案包括以下步驟：

 

  1、抗原固定在ELISA板的表面。

 

  2、使用封閉緩沖液覆蓋板的其余部分。

 

  3、ELISA板與抗原在室溫下孵育抗原特異性抗體。

 

  4、使用讀板器測量反應產(chǎn)物或獲得的信號。

 

  ELISA的最后一步是將含有反應混合物的ELISA板與合適的底物一起孵育。底物的使用取決于您使用的檢測方法，并與抗體酶聯(lián)，例如辣根過氧化物酶(HRP)、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶(AP)。這有助于信號放大和板中發(fā)生的反應的可視化。

 

  ELISA應用中常用的一些底物是過氧化氫、魯米諾和對硝基苯磷酸鹽（pNPP底物）。

 

  在本文中，上海通蔚生物將介紹這些底物在ELISA測定過程中的工作原理、它們的功能以及它們在不同醫(yī)療和生物技術實驗室和行業(yè)中的應用。

 

  ELISA底物如何工作？

 

  ELISA底物通過與綴合的酶結合來檢測測定中使用的抗體。該酶將底物轉化為有色產(chǎn)物或熒光或電化學信號，使用分光光度計、分光熒光計或電化學裝置獲取其吸光度或讀數(shù)，以定量給定樣品中的抗原。

 

  不同的底物在與酶的氧化反應過程中產(chǎn)生不同的顏色。例如，辣根過氧化物酶底物與HRP酶反應后產(chǎn)生以下結果：

 

  1、ABTS（2,2′-Azinobis[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二銨鹽）：綠色

 

  2、TMB（3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺）：橙色

 

  3、OPD（鄰苯二胺）：藍色

 

  產(chǎn)生的顏色量或獲得的信號量與與固定在96孔板表面的抗原結合的一抗的量成正比。

 

  圖：HRP酶與其底物之間抗原抗體復合物形成和氧化反應的圖示

 

  獲得高質(zhì)量、一致、可靠的蛋白質(zhì)測量結果。如今，研究人員使用ELISA試劑盒。這些檢測試劑盒配備了運行特定ELISA檢測所需的所有合適試劑。它們執(zhí)行起來既簡單又快捷。此外，它們具有最低的測定間和測定內(nèi)變異性、高靈敏度和最高可能的批次間一致性。

 

  市場上還有一些底物試劑盒，配有適合ELISA檢測步驟的酶-底物試劑配方。它們使這個過程更快更容易。

 

  ELISA底物類型

 

  根據(jù)所使用的檢測方法，ELISA底物分為以下幾類：

 

  化學發(fā)光底物

 

  報告酶-底物反應中產(chǎn)生的光用作化學發(fā)光檢測系統(tǒng)的信號。用于HRP酶的化學發(fā)光底物溶液包括魯米諾。AP酶需要基于1,2-二氧雜環(huán)丁烷的試劑來產(chǎn)生X射線膠片或電荷耦合器件(CCD)相機捕獲的信號。

 

  為了提高化學發(fā)光信號的強度、持續(xù)時間和靈敏度，檢測過程中還使用了增強化學發(fā)光底物(ECL)。然而，應稀釋底物以防止錯誤的高強度信號。

 

  顯色底物

 

  這些底物與報告酶反應產(chǎn)生有色的不溶性反應產(chǎn)物，并使用分光光度計進行檢測。該方法中使用的HRP底物包括2'-嗪雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)；5-氨基水楊酸（5-AS）；3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)；和鄰苯二胺（OPD）。

 

  AP酶的底物是5-溴-4-氯吲哚基磷酸鹽(BCIP)和硝基藍四唑(NBT)。通過使用終止溶液可以增強所得的比色信號，以獲得更準確的信號測量。

 

  圖：顯色檢測方法的機制說明

 

  熒光底物

 

  熒光ELISA底物需要熒光計能夠產(chǎn)生正確的激發(fā)光束，以便熒光標簽發(fā)出信號。熒光計通過其激發(fā)和發(fā)射濾光片測量信號。

 

  ELISA測定中使用的熒光AP底物是4-MUP（4-甲基傘形磷酸酯），它在440 nm的發(fā)射波長和360 nm的激發(fā)波長處產(chǎn)生信號。HPPA（3-對羥基苯基丙酸）和HPA（羥基苯基乙酸）底物與過氧化物酶配對。

 

  圖：熒光檢測機制的圖示。

 

  為您的ELISA測定選擇合適的底物取決于靈敏度（較低或較高的檢測限）、時間要求以及過程中需要/使用的檢測設備的類型。

 

  ELISA底物有何用途？

 

  ELISA底物對于ELISA測定中獲得的信號的檢測、放大和定量至關重要。它們與酶發(fā)生反應，產(chǎn)生有色產(chǎn)物或信號，并使用合適的設備進行測量。

 

  ELISA檢測

 

  ELISA是一種用于識別和定量生物分子（例如蛋白質(zhì)、肽、糖蛋白和激素）的生化測定法。ELISA的最后一步是對含有抗原抗體（與熒光團或酶結合）復合物的反應混合物以及用于反應可視化的合適底物進行孵育的ELISA板。

 

  底物與HRP或AP酶反應，產(chǎn)生不溶性有色反應產(chǎn)物或信號，由儀器、分光光度計或分光熒光計進行測量。

 

  哪些行業(yè)使用ELISA底物？

 

  HRP和AP是兩種最常用的酶，用于在ELISA檢測中結合抗體來檢測抗原。這主要是因為它們的簡單性和高靈敏度。

 

  在測定中，它們與合適的底物發(fā)生反應，產(chǎn)生用于抗原分析的可測量信號。因此，ELISA底物是ELISA方案的關鍵組成部分之一，并用于許多不同的實驗室和行業(yè)。

 

  制藥

 

  制藥行業(yè)使用ELISA測試來檢測多種疾病，例如流感、艾滋病毒、登革熱和萊姆病。市場上還有一些ELISA試劑盒，可以使工作流程更快、更輕松。

 

  此外，ELISA測定在疫苗開發(fā)中也至關重要。它們檢測針對故意注射到宿主體內(nèi)的抗原而形成的抗體。

 

  食品工業(yè)

 

  在食品工業(yè)中，ELISA檢測用于檢測制成品中的食品過敏原，特別是涉及牛奶、杏仁、花生、核桃和雞蛋。它可以防止食品中的欺詐性替代品并證明其在市場上的真實性。