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維容氏支原體探針法RT-LAMP試劑盒
產品及特點
維容氏支原體(Mycoplasma wenyonii)是引起牛嗜血支原體病的主要病之一，多引起牛貧血、黃疸、發(fā)熱和消瘦等癥狀，對養(yǎng)牛業(yè)造成一定的危害，因此快速檢測維容氏支原體具有重要的意義。為此，本公司開發(fā)了本檢測試劑盒，它具有下列特點：
產品及特點
維容氏支原體(Mycoplasma wenyonii)是引起牛嗜血支原體病的主要病之一，多引起牛貧血、黃疸、發(fā)熱和消瘦等癥狀，對養(yǎng)牛業(yè)造成一定的危害，因此快速檢測維容氏支原體具有重要的意義。為此，本公司開發(fā)了本檢測試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒RNA樣品。
2. 恒溫擴增，可以不需要貴重的熒光PCR等貴重儀器。
3. 含探針，可以進一步提高專一性。
4. 檢測靈敏性可以達到100拷貝/反應左右。
5. 特異性高，擴增引物和檢測探針均根據維容氏支原體RNA保守序列設計，不會跟其他生物的RNA發(fā)生交叉反應。
6. 一般30分鐘內出結果，比RT-PCR快。
7. 提供無傳染性的陽性對照，便于分析實驗結果。
8. 提供內參，便于識別假陰性。
9. 本產品只能用于定性分析，不推薦用于定量分析。
10. 上樣量大，對20 μL的反應體系，樣品加樣量高達到13μL。
11. 內含的dUTP-UNG可防交叉污染。
12. 本產品足夠50次20 μL體系的探針法熒光RT-LAMP擴增。
13. 只可用于科研。
規(guī)格及成分
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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RT-LAMP MasterMix（探針法，待加酶） |
200μL |
0.5mL本色蓋 |
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逆轉錄酶-擴增酶混合液 |
100μL |
0.5mL紅蓋管 |
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20×維容氏支原體RT-LAMP引物探針混合液干粉（含內參引物） |
50次 |
0.5mL白色管 |
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維容氏支原體RT-LAMP陽性對照（1E4拷貝/μL） |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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RT-LAMP通用外源內參（1E4拷貝/mL） |
50μL |
0.5mL綠蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
無 |
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本產品采購五孔盒包裝 |
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注 意：首次使用本產品的時候，需要在引物探針混合液干粉（含內參引物）管中加入60 μL的自備超純水，渦旋震蕩后短暫離心的到引物探針混合液。 |
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使用方法
樣品DNA的制備
樣品DNA的制備
1. 用自選方法純化樣品RNA，本試劑盒跟市場上大多數RNA提取試劑盒兼容，包括本公司的免提取的核酸釋放劑。
2. 如果有N個樣品，則需要做N+2個樣品制備，包括一個樣品制備陽性對照（PC）和一個樣品制備陰性對照（NC）。PC用10 μL本試劑盒提供的陽性對照（1E4拷貝/μL）加一定量的水使得其總體積跟核酸純化試劑盒所要求的起始樣品體積一樣，NC用水替代。
3. N+2個樣品的每個樣品在純化前，每個都要加入10 μL本試劑盒提供的RT-LAMP通用外源內參（1E4拷貝/μL），相當于每個樣品在進行核酸純化前，含有1E5個拷貝的內參分子。
探針法熒光RT-LAMP反應20μL體系
4. 注意：第一次使用一個新的試劑盒時，必須先將100 μL逆轉錄酶-擴增酶混合液全部加入到RT-LAMP MasterMix（探針法，待加酶）中，輕柔吹打半分鐘混勻，蓋上蓋子后再輕柔顛倒1分鐘混勻，然后取用。
5. 反應設置：如果有N+2個RNA純化樣品，則設置N+5個RT-LAMP擴增，增加一個陰性對照、一個內參擴增對照和一個陽性對照。
6. 本產品含兩種探針，故在設置熒光PCR儀時，設置60次循環(huán)，每次65℃保溫1分鐘，采集FAM和Cy5兩個通道的熒光信號。FAM是樣本探針的熒光標記，Cy5是內參探針的熒光標記，淬滅基團均是TAMRA。
結果分析
7. 判斷實驗有效性：擴增陰性對照必須沒有FAM信號的擴增（擴增是指Ct在40以內，熒光信號呈現標準的S型擴增曲線。任何一個不滿足此兩個條件，均判讀為無擴增。下同），擴增陽性對照必須有FAM信號的擴增，否則整個實驗無效，需要分析原因。擴增陰性對照如果有擴增，表示實驗試劑或環(huán)境有模板DNA的污染。擴增陽性對照沒有FAM信號的擴增表示試劑盒或擴增設備或操作有問題，需要分別排查。找到原因并解決問題后方可重啟實驗。
8. 如果實驗有效，則可以分析N+2個樣品的情況。
情況1、FAM信號有擴增，則此樣品應判為陽性，不論Cy5信號有無擴增。
情況2、樣FAM信號無擴增，但Cy5信號有擴增，則此樣品應判為陰性；
情況3、FAM信號和Cy5信號均無擴增，此樣品應判為假陰性（可能原因之一是此樣品中有抑制物，也可能核酸在純化過程中丟失）。此樣品需要稀釋不同倍數后再測或/和重新進行核酸制備。
自備試劑
待測樣品
待測樣品
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
