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木瓜內(nèi)源RbcL基因探針法qPCR試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)
內(nèi)參基因是轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)識(shí)制度中所必需的檢測參照基因。在用PCR對待檢測樣品基因組DNA的轉(zhuǎn)入基因進(jìn)行檢測時(shí)，還需要對內(nèi)參基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，以排除假陰性結(jié)果，保證檢測結(jié)果的可靠。同時(shí)內(nèi)參基因的拷貝數(shù)是固定不變的，因此通過靶基因和內(nèi)參基因的PCR結(jié)果比較，可以對靶基因進(jìn)行相對定量。因此GMO內(nèi)參基因的檢測具有重要的意義。本產(chǎn)品是專用于檢測木瓜（Pawpaw，Chaenomeles sinensis，Csi）內(nèi)源RbcL（Ribulose-1,5-bisphosphate Carboxylase/oxygenase Large Subunit，Rubisco L，核酮糖1，5-二磷酸羧化酶大亞基）基因的探針法qPCR試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
產(chǎn)品及特點(diǎn)
內(nèi)參基因是轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)識(shí)制度中所必需的檢測參照基因。在用PCR對待檢測樣品基因組DNA的轉(zhuǎn)入基因進(jìn)行檢測時(shí)，還需要對內(nèi)參基因同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，以排除假陰性結(jié)果，保證檢測結(jié)果的可靠。同時(shí)內(nèi)參基因的拷貝數(shù)是固定不變的，因此通過靶基因和內(nèi)參基因的PCR結(jié)果比較，可以對靶基因進(jìn)行相對定量。因此GMO內(nèi)參基因的檢測具有重要的意義。本產(chǎn)品是專用于檢測木瓜（Pawpaw，Chaenomeles sinensis，Csi）內(nèi)源RbcL（Ribulose-1,5-bisphosphate Carboxylase/oxygenase Large Subunit，Rubisco L，核酮糖1，5-二磷酸羧化酶大亞基）基因的探針法qPCR試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供DNA樣品。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到100拷貝/μL。
3. 特異性高，根據(jù)木瓜內(nèi)源RbcL基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，能專一性地檢測出樣品中的木瓜內(nèi)源RbcL基因，不會(huì)跟其他基因發(fā)生交叉反應(yīng)，因此不能檢測其他非木瓜內(nèi)源RbcL基因成分。
4. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
5. 所用探針為Cy5標(biāo)記，可以跟其他熒光標(biāo)記的GMO PCR檢測組合成多重檢測。
6. 快速，整個(gè)檢測過程（按一個(gè)樣品計(jì)）所需時(shí)間僅2小時(shí)。
7. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時(shí)線性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級。
8. 本產(chǎn)品足夠50次20 μL體系的探針法熒光定量PCR。
9. 本產(chǎn)品只可用于科研。
規(guī)格及成分
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
0.5mL |
0.5mL本色管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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木瓜內(nèi)源RbcL基因探針法qPCR引物-探針混合干粉 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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木瓜內(nèi)源RbcL基因PCR陽性對照（1E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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超純水 |
1mL |
1.5mL藍(lán)蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
無 |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入165uL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以陽性對照1E1-1E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度和內(nèi)參固定在1E3拷貝/μL為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以陽性對照1E1-1E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度和內(nèi)參固定在1E3拷貝/μL為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3. 在6號(hào)管中加入5 μL陽性對照（濃度為1×10E7拷貝/μL，本試劑盒提供），充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1E6拷貝/μL的陽性對照（上步稀釋所得），充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號(hào)管中加入5 μL 1E5拷貝/μL的陽性對照（上步稀釋所得），充分震蕩1分鐘，得 1E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
樣品DNA的制備
7. 如果有N個(gè)樣品，設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽性對照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0 μL上步所得4號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸純化試劑盒所要求的樣本起始體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果有N個(gè)樣品，則需要進(jìn)行N+2個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽性對照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對照管。
8. 用自選方法純化樣品的DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容，也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qPCR反應(yīng)20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽性對照（用第一步稀釋得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線系列稀釋液的第3號(hào)做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 如果樣本制備陽性對照或PCR陽性對照(包括標(biāo)曲樣本)結(jié)果為陰性，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重新樣本制備，重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增或跟廠家聯(lián)系。如果樣本制備陰性對照或PCR陰性對照結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系。
2. 如果陰性對照和陽性對照均正常，則實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。
3. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Cy5通道的Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Cy5通道的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Cy5通道的Ct必須沒有讀數(shù)，或者大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Cy5通道的Ct值應(yīng)該小于40。對待測樣品，如果其Cy5通道的Ct沒有讀數(shù)、大于或等于40則均為陰性，如果小于40則為陽性。
自備試劑
樣品DNA
樣品DNA
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期2年
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期2年
