產(chǎn)品及特點(diǎn)：
牛冠狀病毒(Bovine Coronavirus，BCoV)屬于冠狀病毒科，冠狀病毒屬2a 亞群，是引起新生犢牛腹瀉、成年牛冬痢和呼吸道感染的重要病原。流行病學(xué)調(diào)查表明，牛冠狀病毒在牛場(chǎng)中普遍存在，主要通過(guò)消化道和呼吸道傳播，感染的牛長(zhǎng)期帶毒并在一定時(shí)期內(nèi)持續(xù)排毒，易造成牛群的大范圍感染。因此，對(duì)帶毒牛的及時(shí)檢出和牛場(chǎng)環(huán)境監(jiān)測(cè)就顯得尤為重要。本產(chǎn)品就是專門用于牛冠狀病毒的快速熒光 RT-PCR 檢測(cè)的試劑盒，在毒牛或牛場(chǎng)環(huán)境的檢測(cè)領(lǐng)域有廣泛用途，
1. 一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對(duì)照。
2. 根據(jù)牛冠狀病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有良好的特異性。
3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測(cè)，靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍，可以達(dá)到至少 1000 拷貝/反應(yīng)。
4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 30μL 體系的 RT-PCR。
規(guī)格及成分：
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編號(hào)
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成分
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規(guī)格
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試劑一
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2×qRT-PCR 緩沖液
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500 μL(棕色管)
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試劑二
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10×qRT-PCR 酶混合液
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100 μL(紅蓋)
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試劑三
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ROX 染料 I，50×
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20 μL(棕色管)
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試劑四
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ROX 染料 II，50×
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20 μL(棕色管)
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試劑五
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熒光 PCR 專用模板稀釋液
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1mL(黃蓋)
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試劑六
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牛冠狀病毒染料法 qRT-PCR 引物混合液
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100 μL(白蓋)
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試劑七
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牛冠狀病毒染料法 qRT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照 (1×10E8 /μL)
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50 μL(黃蓋)
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試劑八
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沙核酸釋放劑(試用裝)
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20 次(1mL，綠蓋)
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試劑九
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使用手冊(cè)
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1 份
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運(yùn)輸及保存：
低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。
陽(yáng)性對(duì)照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
自備試劑：
樣品 RNA。
使用方法：
一、稀釋陽(yáng)性對(duì)照：
以 10E2-10E7 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例，由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同)。
2. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(本試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
3. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備：
5. 如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC(樣品制備陽(yáng)性對(duì)照)，一個(gè)是 NC(樣品制備陰性對(duì)照)。可以用 10μL 上步制備的陽(yáng)性對(duì)照梯度稀釋液中的第 4 號(hào)(濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬(wàn)拷貝)再加上一定量的水作為制備的陽(yáng)性對(duì)照(加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫?duì)照。
6. 用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置RT-PCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）：
7. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照(用水做模板)，1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照(用第 4 號(hào)陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把 6 個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個(gè)，其余不變。
8. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加)：
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成分
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N+2個(gè)制備
所得樣品
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qRT-PCR
陰性對(duì)照
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qRT-PCR陽(yáng)性對(duì)照(2-7管)
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2×qRT-PCR緩沖液
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10μL
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10μL
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各10μL
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牛冠狀病毒染料法qRT-PCR引物混合物
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2μL
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2μL
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各2μL
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50×ROX (見注)
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0.4μL
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0.4μL
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各0.4μL
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樣品制備所得RNA
模板(來(lái)于第8步)
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5.6μL
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--
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稀釋所得6個(gè)陽(yáng)性對(duì)照 (來(lái)于第6步)
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--
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各5.6μL2號(hào)樣到2號(hào) 管,3號(hào)樣到3號(hào)管
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超純水
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5.6μL
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10×qRT-PCR酶混合液
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2μL
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2μL
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2μL
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注： 需使用 ROX 染料 I 的機(jī)型：ABI Prism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-One Plus。
需使用 ROX 染料 II 的機(jī)型：ABI Prism 7500、7500Fast、MJ Research的 Chromo4、Opticon(II)Corbett Rotor Gene 3000。
不需要使用ROX 的機(jī)型：Thermal Cycle Dice Real Time System，LightCycler、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P、RotorGene3000、RotorGene 6000。
9. 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行 RT-PCR(參數(shù)可能會(huì)因儀器不同而需優(yōu)化)。
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過(guò)程
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溫度
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時(shí)間
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RT（逆轉(zhuǎn)錄）
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50℃
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15-30 min
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預(yù)變性
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95℃
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5 min
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Qrt-PCR反應(yīng)40個(gè)循環(huán)
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95℃
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15 sec
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58℃
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1 min,（采集FAM通道的熒光信號(hào)）
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按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行溶解曲線分析
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四、數(shù)據(jù)處理：
10. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。
11. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽(yáng)性。
五、特別提示：
本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！
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