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產品及特點：
BK病毒(BKVirus、BKV)是在一位腎移植后出現腎功能衰竭伴輸尿管狹窄患者的尿液樣本中首次分離得到的一種新型的病毒,隨著器官移植術的廣泛開展及強效免疫抑制劑的使用,BK感染已成為腎臟移植后功能喪失及骨髓移植后急性腎功能衰竭的重要原因。
BKV原發(fā)感染多集中在嬰幼兒時期,通常無明顯的臨床癥狀,或表現為發(fā)熱、輕微呼吸道感染癥狀，對人體的腎功能有巨大危害，因此BK病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的BK病毒染料法熒光定量PCR檢測試劑盒。
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據BK病毒(BKVirus、BKV)保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。
4. 一管式熒光定量PCR檢測，避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠50次20μL反應體系的熒光定量PCR。
規(guī)格及成分：
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編號 |
成分 |
規(guī)格 |
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試劑一 |
2×qPCRMagicMix |
500μL(棕色管) |
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試劑二 |
熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL(黃蓋) |
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試劑三 |
BK病毒(BKVirus、BKV)染料法PCR引物混合液 |
100μL(白蓋) |
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試劑四 |
BK病毒(BKVirus、BKV)染料法PCR陽性對照(1×10E8/μL) |
50μL(紅蓋) |
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試劑五 |
DNA病毒裂解液(試用裝) |
15次(9mL) |
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使用手冊 |
1份 |
低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。
自備試劑：
DNA模板、10×ROX(根據機型決定，具體見使用方法)。
使用方法：
一、稀釋PCR陽性對照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例)：
1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。
2. 標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液(最好用帶芯槍頭，下同)。
4. 在7號管中加入5μL1×10E8拷貝/μL的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在6號管中加入5μL1×10E7拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在5號管中加入5μL1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備：
8. 如果有N個樣品，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC(樣品制備陽性對照)，一個是NC(樣品制備陰性對照)?？梢杂?0μL上步制備的PCR陽性對照的第4號(濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝)或第5號(濃度為1×10E5拷貝/μL，10μL相當于10萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒DNAout或其升級版柱式病毒DNAout。本試劑盒免費贈送15次一管式病毒DNAout。
三、設置qPCR反應(20μL體系，在樣品制備室進行)：
10. 如果只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于 PCR 陽性對照。如果做 2-3 次重復，則反應設置數量相應增加 2 或 3 倍。
11. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加)：
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成分 |
樣品管 N+2個 |
PCR陰性對照管 |
PCR陽性對照管(2-7管) |
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2×qPCR MagicMix(棕色管) |
10μL |
10μL |
各10μL |
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BK病毒(BKVirus、BKV)PCR引物混合液(白蓋） |
2μL |
2μL |
各2μL |
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自備10×ROX(見注) |
2μL |
2μL |
各2μL |
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N+2待測樣品DNA模板 |
6μL |
不加 |
不加 |
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第7步所得PCR陽性對照稀釋液(2-7號) |
不加 |
不加 |
各6μL2號樣到2號管,3號樣到3號管 |
12. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR(具體PCR參數可以根據儀器不同而自行優(yōu)化)。
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過程 |
溫度 |
時間 |
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預變性 |
92℃ |
5分鐘 |
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PCR反應30個循環(huán) |
94℃ |
60秒 |
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50℃ |
60秒 |
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72℃ |
60秒 |
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合DNA時，最大吸收光譜在471nm，結合DNA時的最大吸收光譜在500nm，最大發(fā)射光譜在530nm。信號采集可以設置在復性或延伸步驟。
四、數據處理：
14. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
15. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
五、特別提示：
本公司的所有產品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！
